Quantitatives PCR-Verfahren zum Nachweis von P. jiroveci in respiratorischen Materialien

Zweck der Untersuchung

Diese Methode dient dem quantitativen DNA-Nachweis von Pneumocystis jiroveci aus Patientenmaterialien des oberen Respirationstraktes, vorzugsweise aus BAL. Der positive DNA-Nachweis spricht bei entsprechender Symptomatik des Patienten für das Vorliegen einer Pneumocystis-Pneumonie. Ist jedoch das Beschwerdebild des Patienten untypisch, muss ein positiver DNA-Nachweis nicht zwingend für eine Infektion sprechen, sondern kann auch eine pulmonale Besiedelung mit P. jiroveci widerspiegeln. In diesen Fällen ist jedoch eine deutlich niedrigere Keimdichte zu erwarten. Die vorliegend beschriebene Methode ermöglicht eine Quantifizierung des Ergebnisses mit Angabe der Kopienzahl/µl Probe. Hierdurch soll die Interpretation des Ergebnisses hinsichtlich der Unterscheidung von Infektion und Besiedelung erleichtert werden.

Prinzip der Untersuchungsmethode

Nach Extraktion der DNA aus dem Patientenmaterial wird mit Hilfe der real-time Polymerase Kettenreaktion (qPCR) das MSG-Gen von P. jiroveci amplifiziert und durch eine spezifische, doppelt-fluoreszenzmarkierte Sonde detektiert (Taqman-Prinzip). Durch die 5’-Nuclease-Aktivität der Taq-Polymerase wird im Reaktionsverlauf die Sonde zerstört, dabei wird der Energietransfer zwischen 5’-Reporter und 3’-Quencher-Fluorochrom aufgehoben. Die Detektion der Reporter-Fluoreszenz ist somit ein Maß, welches der amplifizierten DNA-Menge proportional ist. Die Fluoreszenz wird in Echtzeit (real-time) mittels entsprechender Filter im Chromo4 Cycler erfasst und aufgezeichnet. Um die PCR-Reaktion und somit die DNA-Menge in der Patientenprobe zu quantifizieren, werden bei jedem Lauf drei Standards mitgeführt, die eine definierte Kopienzahl/µl MSG-Gen aufweisen. Anhand der Ergebnisse der drei Standards wird eine Standardkurve errechnet, die dann die Bestimmung der Kopienzahl/µl der Patientenprobe ermöglicht. Bei den Standards handelt es sich um in TE-Puffer gelöstes Plasmid (pCR2.1), das eine Kopie des entsprechenden MSG-Genabschnittes von P. jiroveci enthält. Als Multiplex-Ansatz wird eine Interne Kontrolle mitgeführt, anhand derer die PCR-Reaktion auf Hemmung überprüft werden kann.